II. Rudolf, de apja, sőt nagybátyja, I. Ferdinánd tiroli főherceg természettudományos érdeklődése is közismert tény. Rudolf udvari csillagásza a szupernóva felfedezésével híressé vált dán Tycho Brahe volt, akinek a császár csillagvizsgálót is létesített Prágától nem messze. Brahe pedig asszisztensének a kor egyik zseniális matematikusát, Keplert fogadta, és híresen rossz viszonyuk ellenére ráhagyta csillagászati méréseinek hatalmas adattárát, melynek nyomán Kepler megalkotta a bolygók mozgására vonatkozó híres téziseit. Rudolfot a matematika, fizika, csillagászat mellett az alkímia (főleg a bölcsek kövének előállítása) is élénken foglalkoztatta, és nevét Löw rabbi és a prágai Gólem legendájával is kapcsolatba hozták. A császári Kunst- und Wunderkammer, a kincstár, műgyűjtemény és tudományos kabinet különös elegye nemcsak a kor legújabb tudományos felfedezéseinek, hanem különleges ritkaságoknak is helyet adott. A Rudolf prágai kabinetjében felhalmozott kuriózumok összetétele (csak néhányat említve ezekből: rinocéroszszarv, ékszerfoglalatú bezoárkő – amit hatásosnak véltek mindenfajta mérgezés ellen, valójában pedig egy speciális kecskefajtából kinyert, emészthetetlen agyagokból összekövesedett fekete golyóbis –, vízilóbőr, kitömött paradicsommadár, unikornis (narvál) szarv, „sárkánymaradványok” – talán dinoszauruszcsontok) „hasonlatos az akkori tudományban meglévő kettősséghez: a tapasztalatokon alapuló megállapítások és a misztikus, mágikus vagy költői elméletek keveredéséhez”. (Gerszi, 10)  

 A világ feltérképezéséhez és megértéséhez tehát a helyi és a távoli tájak flórájának és faunájának tanulmányozása elengedhetetlennek tűnt. Az új földrészek felfedezésével, a távoli tájakról érkezett egzóták beáramlásával a bécsi és prágai udvar is igyekezett lépést tartani. Miksa Bécs mellett rendezett be állatkertet, Rudolf, aki viszont 1583-ban Prágába tette át székhelyét, a várdomb lejtőjén épített botanikus kertet, halastavat, fácánost, egzotikus madaraknak óriási kalitkát (sisakos kazuár mellett egy legendás dodó madár is élt az udvarban, amit többen megörökítettek), de oroszlánokat, gepárdokat és más nemes ragadozókat is tartott a prágai Fehérhegyen emelt Villa Hvězda (Csillag-villa) parkjában. Mindketten a kor leghíresebb leginbotanikusait foglalkoztatták. Carolus Clusiust még Miksa hívta meg 1573-ban a bécsi császári kertek felügyelőjének, ő a helyi növényvilágot tanulmányozva számos magyar humanistával, többek közt a botanikai érdeklődésű Batthyány Boldizsárral és Beythe Istvánnal levelezett, aki együttműködésük eredményeként egy pannon „növényhatározót”, latin–magyar növény-névjegyzéket is megjelentetett 1583-ban. Clusius a 90-es években a császári szolgálatot elhagyva, a leideni egyetemen hozta létre a kor leghíresebb orvos-botanikai kertjét, és itt adta ki ritka (egzotikus) növényekről szóló nagy hatású értekezését. Viszont még bécsi tartózkodása alatt jutott az akkor világszenzációt jelentő első tulipánhagymákhoz, amelyekből egész gyűjteményt vitt később Hollandiába, nem kis szerepet játszva ezzel az alig két évtized múlva az egész kontinensen végigsöprő „tulipománia” kirobbanásában. Rembert Dodoens pedig – mielőtt szintén a leideni egyetemre ment tanítani – II. Fülöpöt visszautasítva szegődött Rudolf személyes szolgálatába mint udvari orvos. A gyógynövények európai hírű tudósa olyan füveskönyvet állított össze (Cruydeboeck, 1554), amellyel a híres Dioszkoridész-féle De Materia Medica (i. sz. 60–64) herbáriumát felváltó új referenciapontot alkotott, s ebből a kor egyik legtöbb nyelvre és legnagyobb példányszámban lefordított tudományos értekezése lett. (Az antik örökségnek számító De Materia Medica minden magára valamit adó császári-királyi könyvtárban megvolt, V. Károly Pier Andrea Mattiolival készíttetett illusztrált latin nyelvű kommentárt hozzá 1554-ben, amit később cseh nyelvre is lefordítottak – Miksa pedig a konstantinápolyi követ közbenjárásával szerezte meg egy 6. századi, egykor a bizánci császár lányának készített gazdagon díszített példányát.) Az állat- és növényvilág iránti szenvedélyes érdeklődés vezette Rudolfot arra, hogy olyan tehetséges festő-illusztrátorokat találjon, akik a naturáliákról enciklopédikus jellegű képgyűjteményt készítenek. Így került udvarába többek közt Hans Hoffmann, akit a bajor I. Vilmos mellől csábított Prágába.

A nürnbergi származású festő kiváló Dürer-másolatokat és -parafrázisokat is készített: a Mezei nyulat például több változatban is megfestette, melyek közül egy fűben lapuló, akvarell helyett olajjal festett változatot 1585-ben Rudolf vásárolt meg, aki a korában megdöbbentő természethűségű eredeti Dürer-rajzokat is feltehetően Hoffmann tanácsára és közvetítésével szerezte be 1588-ban a nürnbergi kereskedő, Imhoff gyűjteményéből. Így került Rudolf birtokába a már említett híres Mezei nyúl mellett a szalakóta szivárványszínű szárnytanulmánya és az Oroszlán. Dürer királyi pártfogóihoz, V. Károlyhoz és I. Miksához hasonlóan Rudolf is nagyra becsülte Dürer közvetlen megfigyelésen alapuló természeti stúdiumait, melyek az első minden szimbolikus jellegétől vagy narratív kontextusától megfosztott állat- és növényábrázolások közé tartoztak. Hoffmann mellett a németalföldi Joris (Georg) Hoefnagel (később fia, Jacob) készítette a legátfogóbb állat- és növény- „lexikonokat”, melyek Rudolf birtokába jutottak. Hoefnagel Münchenben és Frankfurtban dolgozott, Hoffmannt és Clusiust is jól ismerte, utóbbi nagy hatással volt természetképére. 1575–82 között keletkezett négykötetes, monumentális állatenciklopédiája, a Négy elem az ismert állatokat a levegő lakóitól a vízig, a rovaroktól a halakig rendszerezi.

A németalföldi miniatúrafestészeti hagyományhoz kapcsolódó önálló kis képecskék szeszélyesnek tűnő kompozíciói a hozzáfűzött szövegekkel együtt természettudományos ismereteket és „a kor bonyolult világmagyarázati spekulációiból, morális és filozófiai gondolataiból merített gondolatokat tolmácsoltak a kortársaknak képrejtvényszerű formában”. (Gerszi, 10) Bár nem bizonyítható, hogy a köteteket Rudolf rendelte volna, 1600-ban gyűjteménye részét képezték. Az viszont bizonyos, hogy Hoefnagel a császárnak készítette a Ferdinánd, majd II. Miksa udvari kalligráfusa, a magyar Bocskay György nevéhez köthető, 1560–70-es években összeállított írásminta-gyűjtemény két évtizeddel későbbi illusztrációit. Ez a naturáliákon túl mitológiai képeket, város- és csatajeleneteket is tartalmaz (tevékenysége nálunk leginkább magyar várakról készített metszetei alapján ismert). Hoefnagel élete utolsó hat évét (1601-ben Bécsben halt meg) szentelte a Rudolf korabeli természetfestészet egyik csúcsdarabja, a császár megbízására készült Mira calligraphiae monumenta megalkotásának.

129 Bocskay-féle kalligráfiai mintaoldalt díszített hazai és egzotikus virágok, rovarok és természeti képződmények, termések, kagylók képeivel. Ezt egészítette ki a 21 lapos dekoratív ábécé groteszk rajzokkal és a már említett emblematikus ábrázolásokkal. Hoefnagel rendkívül precízen megfestett növényi és állati kompozícióihoz gyakran használt optikai illúziót keltő eszközöket. A tromp l’oeil technikán kívül (vetett árnyékkal érzékeltetett álhasítékon „bújtatja át” a virág szárát) például azzal, hogy eredeti méretükben, eleven színekkel festette meg a természet kincseit. A kalligráfiai mintalapok fantasztikus indái közé festett kivételes „florilégium” a Habsburg-udvar legendás virágszeretete, a növényritkaságokat gyűjtő és szaporító Rudolf szenvedélye előtt tiszteleg, miközben Arcimboldo Floráival együtt készíti elő a talajt az elkövetkező évszázad egyik legkedveltebb műfaja, a virágcsendélet számára.